Applied Scientific Instrumentation,ASI,diSPIM,ct-dSPIM,54-10-12,54-12-8,oSPIM,選擇性平面照明顯微鏡
什么是SPIM或LSFM？
選擇性平面照明顯微術(SPIM)是一種快速溫和的成像技術，結合了寬視野成像的速度、適度的光學切片和低光漂白。它已經成為一種重要的熒光成像方式，尤其是體積成像。SPIM也被稱為光片熒光顯微鏡(LSFM)或簡稱為“光片”。1
SPIM或LSFM的定義特征是從側面對焦平面進行平面照明。在任何給定的時間，只有樣品的薄部分被照射，使光損傷最小化，并且還提供光學切片，與寬視場落射熒光相比，光學切片提高了SNR。因為圖像是以寬視場(2D平行)方式采集的，光幕成像比一次只檢測一個像素的點掃描共焦顯微鏡快得多。
“不同顯微鏡照明模式的比較(LSFM:光片熒光顯微鏡，WF:寬視野顯微鏡，CF:共焦顯微鏡). “經過JKrieger在CC BY-SA 3.0下使用，維基共享，6月7日泰國(Thailand), 2013.
由于三個關鍵特征，光幕顯微術在體積成像方面迅速獲得了普及:首先，由于激發被限制在焦平面附近，光損傷被最小化，例如生物存活更長時間。第二，獲得良好的光學切片，通常接近共焦顯微鏡。第三，采集速度非?？?，比傳統的共焦顯微鏡快幾個數量級。
SPIM的主要缺點是需要額外的光學元件來產生光幕。最常見的是，將單獨的照明物鏡放置成與檢測物鏡正交，并且將薄片生成光學器件放置在該照明物鏡和激光源之間。增加額外的透鏡會給成像系統和樣品安裝帶來空間限制。本質上，顯微鏡需要圍繞樣品進行設計，因此有各種各樣的光片顯微鏡設計，每種設計都最適合不同的樣品和不同的安裝要求。相比之下，傳統的共焦或落射熒光顯微鏡只有一條光路，可以容納更多種類的樣品。換句話說，SPIM的優勢是以任何單一工具更狹窄的適用性為代價的；這導致了不同光片顯微鏡配置的激增，每種配置都有自己的優缺點。
1有些人保留術語“SPIM”來表示由柱面透鏡產生的靜態光幕，而不是掃描光束來產生光幕。包括ASI在內的其他公司將SPIM等同于LSFM，部分原因是可以輕松地改變光幕發生器的類型，同時保持相同的顯微鏡配置。
ASI能幫上什么忙？
十多年來，應用科學儀器公司(ASI)一直采用模塊化方法來構建顯微鏡，自2010年代初以來，我們增加了專門針對光片顯微鏡的組件。ASI的模塊化組件可以很容易地組合成一個完整的SPIM顯微鏡，包括電動和壓電臺，光學機械，以及用于創建和移動光幕的掃描儀。需要物鏡、激光器、濾光器和照相機來完成該系統；用戶可以自己從相應的制造商那里購買這些其他項目，使用轉售ASI硬件的各種系統集成商的服務，或者通過ASI購買。
ASI提供多種標準配置的薄片顯微鏡，包括iSPIM、diSPIM、oSPIM和ct-dSPIM。此外，使用ASI的組件極大地簡化了定制/DIY光幕系統的構建。
也許實現光片顯微鏡最困難的方面是同步各種組件，包括樣品移動、照相機、激光器和移動光束以產生光片。這些亞毫秒計時事件由ASI的控制器根據先前通過串行命令發送的設置進行處理。此外，意大利航天局還貢獻了一個免費的開源微管理器插件，使配置相關的控制器設置和獲取SPIM數據集變得容易。
生成光幕
產生一片光有兩種主要方法。柱面透鏡或類似元件可用于將光聚焦在一個軸(板厚度)上，同時使光在另一個軸(板寬度)上傳播，從而一次性照亮整個視場。這通常被稱為“靜態”表。另一種方法是在成像相機的每次曝光過程中，使用檢流計鏡掃描穿過視場的光束，有時稱為“數字”或“掃描”片。每種方法都有優點和缺點。靜態片及時分散激發劑量，可以減少光損傷，并且產生起來不太復雜。然而，由于光源的來源是高斯光束，照明強度在整個區域內通常不是恒定的。數字片在容易改變的寬度上是均勻的，具有“停止運動”效果，這有利于移動樣品，并且可以與相機的滾動快門結合用于1D共焦。由于sCMOS相機讀數，靜態片通?？梢垣@得更高的幀速率。但是滾動快門可以允許在多視圖方案中同時創建多個光幕。
理想的光幕應該非常薄，其強度完全限制在檢測物鏡的焦平面上，并且足夠長以覆蓋成像光學器件的整個視場。但是物理學介入了。聚焦的光線會發散，所以薄片越薄，薄的區域就越短。薄板相對較薄的距離稱為共焦長度，通常與薄板厚度成平方比例。實際上，共焦長度通常與樣品或視場的大小相匹配。
大多數情況下，板材具有近似高斯的輪廓，因為激光源源自高斯光束。對于靜態片的情況，該高斯輪廓在聚焦方向上，數學上與掃描高斯光束相同。高斯光束/片的厚度和共焦長度可以解析地推導為:
腰部厚度= k1 *λ/nail 1
共焦長度= k2 *λ/(nail 1)2
其中k1和k2是無量綱常數，取決于厚度和共焦長度的選定定義，λ是真空波長，NAill是照明光束的數值孔徑。對于常見定義，k1=k2=0.64。照明NA可以不大于照明光學器件的NA，但通常只是它的一小部分，從而如前所述，共焦長度足夠大。
非高斯光束已經被用來產生包括貝塞爾光束、艾里光束和貝塞爾光束陣列的光幕。貝塞爾光束和艾里光束具有理想的無衍射或自愈的特性，這減少了陰影。相對于共焦距離，貝塞爾光束比高斯光束細得多，但是在中心薄瓣之外包括大量的激發光，增加了光損傷?？梢允褂秘惾麪柟馐嚵校渲嘘嚵虚g距通過相消干涉(一種“點陣”)使離焦光最小化，這可以具有極好的效率，但是需要非常復雜的薄片生成光學器件，并且對樣品散射和像差非常敏感。在更簡單的方案中，干涉也可以用來減小薄板厚度。對于這種非高斯光束，共焦長度和厚度之間的基本折衷仍然存在，只是比例因子不同。
樣本中的不透明區域會阻擋光幕，導致條紋假象，即照明光永遠無法到達的陰影。這可以通過使用與成像平面共軛的檢流計旋轉光幕來減輕，并且被稱為抗條紋。
為了收集3D或體積信息，要么需要將光幕移動通過樣品，要么需要將樣品移動通過光幕以產生一疊圖像?？梢允褂脵z流計鏡來移動光幕，并且檢測物鏡的焦平面需要前后移動(通常使用壓電臺)?；蛘撸梢允褂秒妱踊?a href="http://ydzhly.com/asiimaging-stages/tag/%e5%8e%8b%e7%94%b5%e8%bd%bd%e7%89%a9%e5%8f%b0/" title="View all posts in 壓電載物臺" target="_blank">壓電載物臺將樣品移動通過空間靜止的光幕。雖然疊置期間的采集速度主要受照相機速度和樣品亮度的限制，但是壓電載物臺對于快速體積成像是優選的，因為它們可以比電動載物臺更快地飛回到初始位置。電動載物臺是大型和/或扁平樣品的首選。
光學分辨率
如前所述，貝塞爾光束和晶格可以實現非常薄的光幕，代價是額外的復雜性。貝塞爾光束和類似的光束受到大量離焦光的影響，但對于多光子和樣品來說是有用的，在這些情況下克服陰影偽影比過度光損傷更重要。晶格對樣品引起的像差非常敏感，但對小樣品可能有用。
橫向(XY)分辨率與寬視野顯微鏡相同，與檢測NA成反比。橫向分辨率通常比軸向分辨率好得多，與其他顯微鏡方法相同。
軸向(Z)分辨率更復雜?；€軸向分辨率是檢測物鏡的景深，它與檢測NA的平方成反比。然而，如果光幕比景深薄，則軸向分辨率可以提高。有效軸向分辨率是激發和檢測PSF的卷積(照明PSF實際上由于片發散而略有變化，但可以近似為束腰)。
如果探測數值孔徑較低(例如0.2)，景深會很大，通常可以產生足夠薄的光幕來提高軸向分辨率。然而，即使如此，與橫向分辨率相比，軸向分辨率通常仍然很差。
對于高NA檢測物鏡(例如NA 0.5及以上)，景深為幾個微米，并且很難在實際的大視場上產生比這更薄的片。在這種情況下，光幕比景深稍厚，因此軸向分辨率與寬視場成像相同，光學切片是有幫助的，但并不完美。因此，所得數據的去卷積可以通過將離焦光重新分配給光源來提高圖像質量。
如果采集到較小的視場并“平鋪”在樣品上，那么可以使用較薄的片來提高軸向分辨率。然而，這增加了光子劑量并可能增加了采集時間。從概念上講，隨著視場變小，這些“平鋪”或“軸向掃描”方案變得越來越共焦，與具有大視場的SPIM相比，導致低光子效率和增加的光漂白。
如果樣本是從不同的有利位置成像的，那么這些單獨的3D數據集可以被組合成具有提高的分辨率的單個3D數據集。例如，在diSPIM中，采集同一樣本的兩個正交視圖，每個視圖具有良好的橫向分辨率和較差的軸向分辨率。然而，每個軸向方向對應于另一視圖中的橫向方向。在配準和聯合反卷積之后，可以產生具有各向同性“橫向”分辨率的單個數據集。相同的方法通常應用于在來自不同視圖的圖像集合之間旋轉的樣本。數據后處理通常比采集需要更多的時間和精力，但只需要在已知良好的數據集上進行(通過查看各向異性的單個疊加)。此外，多個視圖之間的配準要求樣本在它們之間顯著相同，即樣本不能顯著移動或變形。
配置
ASI提供多種模塊化顯微鏡元件，可輕松實現薄片顯微鏡，包括:
- 電動和壓電載物臺
- 靜態或掃描紙張的光幕發生器
- 用于遠程聚焦和平移束腰的可調透鏡
- 所有相關的控制電子設備，包括這些元件與攝像機和激光器的協調
- 光學機械，例如濾光器支架、運動鏡、鏡筒
- 透明組織成像物鏡
- 通常用于無限顯微鏡的其他模塊包括硬件自動對焦、LED照明器、轉盤和物鏡轉換器、自動和手動濾光滑塊、自動和手動端口開關、濾光輪等。
Applied Scientific Instrumentation,ASI,diSPIM,ct-dSPIM,54-10-12,54-12-8,oSPIM,選擇性平面照明顯微鏡
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