以 AOTF-近紅外光譜技術建立心通口服液快速分析方法

[摘要]： 目的：應用聲光可調濾光器（AOTF）-近紅外光譜技術和化學計量學方法建立一種 用于心通口服液快速定性、定量分析的新方法。方法：采用 PCA 主成分分析和偏最小二乘法 分別進行定性定量分析。結果：建立的 XT-C 定性分析模型可正確判斷心通口服液；建立的 定量模型準確性好，葛根素的內部交叉驗證均方差是 RMSEP=0.137 1，決定系數 R2=0.984 5, 經對外部驗正集樣品進行外部驗證，葛根素預測值與真值的相關系數是 r2=0.996 4，預測值 的平均回收率為 101.9%(RSD=1.189 %,n=5)。方法精密度 RSD 為 1.98% （n=20），方法穩定 性 RSD 1.57%（n=5）。結論：該方法是一種簡便、快速、低耗的新型分析技術，可用于 為心通口服液的快速定性定量分析。

[關鍵詞]：聲光可調濾光器；近紅外光譜技術；心通口服液； 主成分分析；偏最小二乘；葛根素；快速分析

? ? 心通口服液為臨床用于治療冠心病、心絞痛的常用中成藥,在 2005 版《中國藥典》中心 通口服液分別以葛根素、丹參素鈉和黃芪甲苷為對照品采用薄層色譜法定性分析，以葛根素 為指標成分，用 HPLC 進行定量分析[1]，被分析樣品需要分別進行化學預處理，操作煩瑣， 完成一個樣品定性定量分析需要 6-8h。近紅外光譜分析技術是一種現代高新分析測試技術， 國外應用該技術在西藥成分檢測與質量控制方面已相對比較成熟，美國食品藥物管理局（FDA）、歐洲和加拿大藥物局正式采用近紅外光譜分析技術取代煩瑣費時的分析方法，國內 在近紅外光譜分析領域也取得了重要進展，2005 版《中國藥典》也將“近紅外分光光度法 指導原則”列入目錄。近年來，近紅外光譜分析技術以其獨特的優點開始應用于中藥分析[2–5], 研究工作者多采用傅立葉變換近紅外光譜儀。AOTF-近紅外光譜分析儀它采用了航天技術中 的“聲光可調濾光器”（AOTF）作為分光元件，這種新型的近紅外光譜儀具有結構簡單、體 積小、重現性好和儀器環境適應性強的特點，試驗分析既可在實驗室內進行，也可用于現場 即時分析，現已開始應用于煙草及化工行業[6]，本研究采用 AOTF-NIR 光譜分析技術和化學 計量學方法，建立了心通口服液定性、定量分析數學模型，采集一次光譜數據即可完成定性、 定量分析，整個操作過程可在 3-5min 內完成，為心通口服液的快速分析提供了一種新方法， 同時為實現心通口服液的在線質量監控奠定了基礎。

1??? 儀器與試藥

1.1 儀器

美國 BRIMROSE 公司生產的 Luminar 5030 型便攜式 AOTF 技術近紅外光譜儀，主要部件 有：光學部分、控制部分、筆記本電腦等。儀器波長范圍為 1 100 nm~2 300 nm，波長增量 2 nm，掃描次數為 300，采用 InGaAs 檢測器。挪威 CAMO 公司 The Unscrambler 分析軟件。Waters1525 色譜儀（美國 Waters 公司），Waters 2996 二極管陣列檢測器，Empower 色譜工 作站。

1.2 試藥

葛根素對照品（中國藥品生物制品檢定所,批號 110766-200417 供含量測定用）；甲醇、丙酮為色譜純試劑；水為超純水。 心通口服液樣品（山東魯南厚普制藥有限公司提供）；雙黃連口服液、銀黃口服液、小兒清熱止咳口服液、安神補腦液、藿香正氣口服液、清開靈口服液、小兒肺熱咳喘口服液、 健兒消食口服液、鼻竇炎口服液、腦心舒口服液等（購自濟南藥業集團有限責任公司等）。

2?? 方法與結果

2.1??? 樣品準備

2.1.1 校正集與驗證集樣品 在定性分析中，選擇山東魯南厚普制藥有限公司提供的 52 個 不同批號心通口服液，40 個樣品組成校正集，12 個樣品組成驗證集。在定量分析中，為消 除建摸樣品的含量范圍和分布對所建校正模型性能的影響,本研究中除山東魯南厚普制藥有 限公司提供的不同批號心通口服液樣品以外,還摸擬車間生產條件在實驗室制備部分樣品以 拉大含量分布范圍，共收集樣品 57 批,將 57 批樣品分為校正集和驗證集,其中驗證集 5 批均 來自山東魯南厚普制藥有限公司。

2.1.2???? 口服液對照品?? 分別由雙黃連口服液（Shl01- Shl10）、銀黃口服液（yh01- yh05）、 小兒清熱止咳口服液（qyzk01- qyzk02）、安神補腦液（asbn）、藿香正氣口服液（hxzq）、 清開靈口服液（qkl）、小兒肺熱咳喘口服液（fykc）、健兒消食口服液（jexs）、鼻竇炎口服 液（bdy）和腦心舒口服液（nxs）等 10 個品種組成。

2.2 近紅外光譜采集及光譜預處理

使用美國 Brimrose 公司 Luminar 5030 型近紅外光譜儀，通過安裝的液體測量專用光纖 探頭采集樣品的光譜數據。準備 18×180mm 的試管，清洗干凈涼干備用。將 Luminar 5030 近紅外光譜儀通電開啟，用專用的網線連接儀器與筆記本電腦，預熱時間為 0.5h。

將液體測量專用探頭安裝到儀器的手持部分，探頭的光程為 10mm，測量方式為透反射 測試。測量時，將口服液樣品小瓶的密封口打開，倒入一備用的試管中，將光纖探頭插入試 管中的液體，液體要將光纖探頭的缺口部分完全覆蓋，輕微晃動探頭，將缺口部分可能存在 的氣泡消除，穩定以后，開始掃描光譜。掃描完成，將探頭取出，用吸水紙擦拭干凈殘留液 體后，進行下一個樣品的掃描。每一張光譜都是 100 次掃描的平均結果，波長范圍從 1 100 nm 到 2 300nm，波長增量為 2nm。每個樣品重復掃描 3 次，得到原始光譜。

在建立模型前，首先對掃描得到的原始吸收光譜進行光譜預處理，以消除噪音和基線漂 移的影響。我們采用的預處理方法為一階導數 9 點平滑法（savitzky-golay），經一階導數 處理可以很好地消除樣品由于顏色差別引起的光譜基線偏移和漂移。11 種口服液的原始光譜與一階微分光譜見圖 1.

圖 1?? 口服液近紅外原始光譜圖和一階導數光譜圖

A、B－心通口服液???? C、D－雙黃連口服液???? E、F－銀黃口服液?????? G、H－其它 8 種口服液

2.3 建立心通口服液定性分析模型

在 52 個心通口服液樣品中，隨機取出 40 個樣品組成校正集（名稱為 xt-c），用于建立 心通口服液 XT-C 定性分析模型，其余 12 個樣品作為驗證集（名稱為 xt-v），用來驗證所建 立 模型 的 預測能 力 。 將 校正 集 樣品 光譜 經 過 一 階 微 分處 理 后 的光譜 數據 導入 The Unscrambler 分析軟件，然后利用 PCA（主成分分析）對光譜數據進行計算，建立心通口服 液 XT-C 定性分析模型，40-個校正集樣品的 PC1、PC2 主成分空間分布圖見圖 2。

圖 2.??? 校正集心通口服液的 PC1、PC2 主成分空間分布圖

2.3.1 檢測模型效果

2.3.1.1????? 模型預測方法?? 對以 PCA 主成分分析法建立的心通口服液 XT-C 定性分析模型性能 的預測，可采用以下兩種方法：一是通過計算機 Excel 表格顯示的方法，二是模型區域判別 法，見圖 3。在圖 3 左側表格中，如果在 Excel 表中樣品編號后面是空白，說明該樣品被檢 測為不屬于 XT-C 模型內樣品，如果樣品編號后面有*號標記，說明該樣品被檢測為屬于 XT-C 模型內的樣品；圖 3 右側是當 cignificance =5%時校正集樣品形成的 XT-C 模型分布區域圖， 如果被檢測的樣品 x 落在 XT-C 定性分析區域內，說明被檢測的樣品屬于心通口服液，反之， 說明被檢測的樣品與建模樣品不相同。

2.3.1.2????? 定性分析模型預測已知心通口服液樣品（xt-v 驗證集）? 調用 40 個校正集心通口服液樣品所建立的定性分析模型 XT-C，對 12 個驗證集樣品進行預測，得到的結果見圖 3。 圖 3 右側圖中在表格中所有 12 個驗證集樣品編號后面均有*號標記，說明他們屬于模型內樣 品，在模型區域圖中，12 個驗證集樣品均落在 XT-C 模型區域內，說明被檢測的樣品與建模 樣品相同，被 XT-C 定性分析模型認可，兩種方法都說明被檢測的樣品屬于建模樣品，即是 心通口服液。

圖 3???????? XT-C 模型預測驗證集樣品結果

2.3.1.3????? 定性分析模型預測口服液對照品?? 調用 XT-C 定性分析模型，分別對雙黃連等 10 種口服液對照品進行預測，得到的結果見圖 4-6。由圖 4-6 可見，口服液對照品在 Excel 表 格中的樣品編號后都沒有*號標記，說明他們不屬于模型內樣品，在模型區域圖中，口服液 對照品均沒有落在 XT-C 模型區域內，以上兩種方法均說明被檢測的樣品與建模樣品不相同， 被 XT-C 定性分析模型排除，即不是心通口服液。

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圖 4???? XT-C 模型預測銀黃口服液樣品結果????????????? 圖 5?? XT-C 模型預測雙黃連口服液樣品結果

圖 6?? XT-C 模型預測其他口服液樣品結果

2.4 建立心通口服液定量分析模型

2.4.1 HPLC 分析 將上述 57 個樣品按 2005 版《中國藥典》心通口服液項下含量測定方法 測定樣品中葛根素含量，每份樣品重復測定 3 次，相對偏差小于 1.5%，以 3 次含量測定結 果的平均值為樣品中葛根素的含量。

2.4.2 建立 PLS1 數學模型 將經過預處理后的光譜數據與 PHLC 分析數據進行關聯，采用 偏最小二乘法（PLS1），交叉－驗證法（cross-validation），用 The Unscrambler 定量分析 軟件建立定量分析模型。NIR 和 HPLC 測定的異常值分別采用光譜影響值 Leverage 和化學值 誤差 Residual 這兩個統計量來檢驗剔除。經過異常值的剔除進行優化，得到了較為理想的 校正模型見圖 7。葛根素模型的主成分維數為 5，該模型的決定系數 R2=0.984 5, 內部交叉 驗證均方差 RMSEP=0.137 1。

圖 7???? 葛根素預測值與真值之間的相關圖

2.4.3 檢測模型效果 以 PLS1 建立的葛根素定量分析模型對 5 份外部驗正集樣品進行分 析,得到樣品葛根素的 NIR 光譜預測值與 HPLC 分析值之間相關性良好,葛根素 NIR 光譜預測 值與 HPLC 測定真值的相關系數 r2=0.9956.

2.4.4 精密度實驗 取 1 個預測樣品,重復掃描 20 次,將所得光譜帶入建立的葛根素定量分 析模型計算含量,以考察方法的精密度,結果葛根素含量的 RSD 值為 1.98%，說明儀器精密度 良好。

2.4.5 穩定性實驗 取 1 個預測樣品，每 1h 掃描一次，于 5h 內重復掃描 5 次，考察樣品的穩定性,結果葛根素的 RSD 值為 1.193%，說明樣品在 5 小時內相對穩定。

2.4.6 預測回收率實驗 取 5 個預測樣品,分別掃描, 將所得光譜帶入建立的葛根素定量 分析模型中,計算葛根素預測值與 HPLC 測定的真值之間的比值(預測回收率), 葛根素的平 均預測回收率為 101.9%,RSD 為 1.189%，結果見表 1。

表 1 葛根素預測回收率結果（n=5）

Tab 1??? predicted recovery test of puerarin

3?? 討 論

3.1 心通口服液是由山東魯南厚普制藥有限公司獨家生產，由不同批號心通口服液建立的 XT-C 定性分析模型，可對樣品心通口服液進行準確的判定。同時，對銀黃口服液等 10 種口 服液對照品也能夠準確地預測為不屬于心通口服液。因此，該模型可用于心通口服液的快速 定性分析；用 57 個樣品建立的葛根素定量分析摸型，經外部驗正集樣品驗證，葛根素預測 值與真值的測定結果趨于一致，方法的精密度、穩定性和預測回收率良好，可滿足藥物分析 的要求。

3.2 采用 Luminar 5030 便攜式近紅外光譜儀對心通口服液樣品直接進行掃描測定，只需對 待分析樣品采集一次光譜數據，分別調用定性、定量分析摸型，經計算機處理在 3-5 分鐘內 即可完成定性、定量分析，由計算機直接讀取分析結果，不用化學預處理、速度快，效率高。

3.3?? 鑒于 AOTF 近紅外光譜儀環境適應性強的特點，檢測過程既可在實驗室進行，也可用于其他場所的現場快速分析，因此，以 AOTF 近紅外光譜技術建立的心通口服液快速分析方法， 不僅可用于心通口服液在藥品流通領域中的快速質量評價，而且為建立心通口服液生產過程 中的在線質量鑒控奠定了基礎。